ゲノム工学とイメージングサイエンスに基づく生命システム研究の新展開

次世代シーケンサー等により、ヒトをはじめとした脊椎動物ゲノムに関する膨大な塩基配列データが蓄積されつつある。しかしながら、高等動物の全体像の理解やそこに到る戦略は不十分である。とりわけ脳神経系の機能の解析には様々な困難があり、期待されるように進んでいない状況にある。このような状況においては、行動と遺伝子とを連関させる新しい遺伝学の開拓が是非とも必要である。本研究では、モデル生物の一つであるゼブラフィッシュを用いて「行動突然変異体」を系統的に分離・収集し、それらをゲノム工学とイメージングサイエンスの手法を駆使して、ゲノム・遺伝子レベル、細胞レベル、器官レベル、個体レベルで解析した結果を糾合して、次世代の「行動遺伝学」「神経遺伝学」「神経系の進化学」などの新しい遺伝学の分野を創出することを目指すものである。

①研究の背景：
次世代シーケンサー等により、ヒトをはじめとした脊椎動物ゲノムに関する膨大な塩基配列データが蓄積されつつある。それらからは、核酸・蛋白質などの生体素子の情報や、それらの進化に関する多くの情報が抽出されて、近年の生命科学の飛躍的発展の基礎となっている。複雑な細胞間相互作用の結果生み出される高等生物の全体像の理解も、その発展の先に期待されるものであるが、そこに到る戦略はまだ十分に理解されていない。最も複雑な機能を持つともいえる脳神経系の機能の解析においては、近年のゲノム科学と遺伝子工学技術の発展による新しいアプローチが始まり、ニュ－ロン間の相互作用と神経回路形成の機構の一部が明らかにされ始めてはいるが、これまでに電気生理学や解剖学的手法で明らかにされた事実の範囲を越えては進展していない。

②研究の必要性：
本プロジェクトでは、次の飛躍を目指すアプローチの戦略を生み出すことを目指す。そのためには、遺伝子機能解析、脳神経回路やその活動を可視化する、などの手法を、「動物行動」と関連させて解析することができるモデル生物実験系を開発し、遺伝子から動物行動までの分子間、細胞間相互作用を連続的に理解する戦略を考える必要がある。そこでは、行動突然変異体を系統的に収集でき、遺伝子工学手法で生体のままで神経回路活動を可視化でき、行動に関連する遺伝子の進化に関しても実験や考察が可能な実験系の工夫が必要である。これらの個々の実験システムにはそれなりの研究者が育っているが、それらを糾合して新しい研究分野を発展させることは、高等研プロジェクトのような機会を捉えて行うことが最も適切であると考える。
本プロジェクトでは、これらの技術とアプローチを総合的に行うために最も適したモデル実験系として、小型熱帯魚ゼブラフィッシュを取上げる。ゼブラフィッシュは、1990年代半ばからモデル脊椎動物として世界中の研究者によりさかんに用いられてきた。その特長は、第一に小型で飼い易く多産で世代交代時間が短いこと、すなわち遺伝学的アプローチが可能であること、第二に体外受精し胚発生が非常に早く胚が透明であること、すなわち発生・器官形成過程の様々な生命現象の観察・操作が容易であることがあげられる。また成体も半透明で、蛍光などによる脳神経細胞の可視化が生きたままの状態で行える。また本プロジェクトの代表者によって開発されたトランスポゾンを利用した遺伝子導入法により、特定の細胞(群)をGFP等の蛍光蛋白質を用いて可視化したり、行動時の遺伝子活動をモニターすることが可能となっている。これらの技術を持つ研究者が一堂に会して総合的アプローチを議論することが、次世代の「行動遺伝学」「神経遺伝学」「神経系の進化学」などの芽を育てていくために重要であると考える。

③研究の方針：
ゼブラフィッシュ研究は、2000年代にはいり、本研究代表者である川上によるトランスポゾン転移技術の開発により、飛躍的に発展することとなる。この技術の開発によりトランスジェニックフィッシュの作製が容易になり、細胞の可視化等の研究が強力に推進され、形態形成・器官形成研究が大きく発展することとなった。最近、新型２光子顕微鏡、光シート顕微鏡等の開発とあいまって、細胞の可視化とそれに基づく研究は、ますます発展が期待される分野である。
一方、細胞の可視化だけでなくその活動を計測するための技術開発も2000年代にはいって活発になってきた。その代表的なものは、本研究に参加する中井が2001年に開発に成功した細胞内カルシウム濃度を測定できるプローブGCaMPである。GCaMPを用いると特定の神経活動を容易に計測できる。中井の発明は、モデル動物を用いた神経機能研究に新しい分野を切り拓くこととなった。
本プロジェクトでは、まずこれらの基礎技術を、正常行動パターンや行動突然変異体の解析に適するために必要な研究・方法について討論する。第一に、ゼブラフィッシュの中枢神経系全体を対象にし、１個１個の神経細胞の活動を検出し、記述するためのシステムの構築・開発について研究（議論）する。第二に、そのようにして検出された神経活動を実際の行動と対応づけるための方法・ツール等、何が必要か？について研究（議論）する。第三に、そのようにして得られた結果から、動物がもつ基本的な行動を規定する基本的な神経回路はどのようなものか、それらを基にしてどのようにして複雑な神経ネットワークが構築されているのか、を明らかにするための方策を研究（議論）する。
本プロジェクトの目的を達成するため、さまざまな視点からゼブラフィッシュ研究を行っている研究者に参加してもらう。研究代表者の川上（遺伝研）は、脊椎動物におけるトランスポゾン転移システムを世界に先駆けて開発してきた。さらに、モデル脊椎動物ゼブラフィッシュにおけるトランスポゾン転移システムを用いた遺伝学的方法論を独自に開発してきた。これらにより、ゼブラフィッシュのさまざまな発生段階において、さまざまな細胞、組織、器官を特異的にラベルし、また活性を調節することが可能になってきた。最近では中枢神経系の神経活動のイメージングを成功している。日比（名古屋大）は、ゼブラフィッシュ変異体を用いた形態形成研究に優れた業績をあげ、最近では小脳の研究を展開している。平田（遺伝研）は、ゼブラフィッシュ変異体と電気生理学的解析を結びつけ、神経発生、神経機能研究を行っている。瀬原（京都大）は、発生過程における細胞の動態、細胞間相互作用に関する研究を行なっている。近藤（大阪大）は、ゼブラフィッシュの色素パターン形成にチューリングパターンの概念を導入し、これに関する理論的、実験的研究を行なっている。また、ゼブラフィッシュを用いた研究をより有意義に発展させるためには、他のモデル動物からのインプットが不可欠である。岩里（遺伝研）は、マウス変異体、コンディショナルノックアウトの遺伝学的手法等を駆使して遺伝子と行動を結びつける研究を成功させてきた。瀬原は、ゼブラフィッシュ研究に加えてマウス研究にも造詣が深い。さらに瀬原からはヒト疾患に関連した分野のインプットも期待できる。両者の研究分野からのインプットにより、ゼブラフィッシュのモデル生物としての意義付けを深めることが可能である。一方、前述にように中井（埼玉大）は、カルシウムインディケーター蛋白質GCaMPを独自に開発し、神経活動をはじめとした細胞活動をリアルタイムで観察することを可能にした。また国際高等研究所の堀田にも(アドバイザーとして)参加を要請し、行動突然変異体による行動遺伝学アプローチに上述の新しい技術的発展をいかに応用していくかについて考えてもらう。これらのメンバーが有機的に結びつくことにより、遺伝学研究、ゲノム科学研究、神経科学研究、発生生物学研究、動物行動学、理論生物学、イメージング研究など多方面の研究を統合して、新展開をはかり、本プロジェクトを推進する。

モデル動物、ゼブラフィッシュ、ゲノム科学、イメージング科学、生命システム

海外研究者の経費等を考慮して年１回の開催とする。
2014年10月頃、２泊３日（於　高等研）６０名程度

2012年度：
第１回研究会における主な成果を以下に記す。
１．Development and neuronal application of G-CaMP-type genetically encoded Ca2+ indicators with high-sensitivity and high-responsivity
神経の活動を可視化することができる最新のツール（カルシウムインディケーターGCaMP）について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：大倉、中井）
２．Real-time visualization of neuronal activity during perception
GCaMPを用いたイメージングにより、外界の様子が視覚を通じて、どのように脳に投影されるかについて理解を深め、議論を行なった。（話題提供：武藤、川上）
３．Studying neural circuit function in zebrafish habenula
GCaMPを用いたイメージングにより、脳における匂い刺激情報処理について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：Yaksi）
４．Neural circuit basis of olfactory behavior in zebrafish
嗅覚刺激が、どのように脳に投影され、動物の行動につながるかについて理解を深め、議論を行なった。（話題提供：吉原）
５．The roles of the habenula in aversive learning and gain of self-confidence in aggressive behavior
脊椎動物の脳における「情動のスイッチ」とも言うべき手綱核の構造と機能について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：岡本）
６．Interaction among the pigment cells forms the Turing pattern in the skin of zebrafish
細胞間の相互作用における理論的背景（チューリングモデル）について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：近藤）
７．Quantitative detection of TALEN-mediated genome modifications in zebrafish器官形成（心臓形成）の遺伝学における新しい遺伝子改変技術Talen法の効果的な利用について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：川原）
８．An update on reverse genetics of zebrafish
ゼブラフィッシュにおけるTalen法の応用による初めての相同組換えの成功について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：Lin）
９．Exploring roles of ADAM proteases in development using zebrafish
ADAMプロテアーゼファミリーによる脊椎動物器官形成制御について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：瀬原）
１０．In vivo imaging of dendritic refinement of barrel cells in the neonatal mouse cortex
マウス脳バレル皮質（ひげからの感覚情報の中枢）におけるシナプス形成の分子機構について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：岩里）
１１．Optogenetic control of glia and mind
チャネルロドプシンを用いた神経活動の光制御（オプトジェネティクス）による脳機能研究について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：松井）
１２．Functional analysis of locomotor circuits in the spinal cord and brainstem
電気生理学的アプローチとオプトジェネティクスを用いた運動を制御する中枢神経系神経回路の精緻な解析について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：東島）
１３．Dopaminergic gating of visual flow to auditory escape circuit via inhibition
動物の運動における聴覚刺激と、視覚刺激の相互作用について神経回路レベルでの理解を深め、議論を行なった。（話題提供：Du）
１４．Formation and function of glycinergic synapse in zebrafish
運動を抑制的に制御するグリシン作動性シナプスの形成機構について理解を深め、議論を行なった。（話題提供：平田）
第１回研究会における上述の議論を通じて、
（１）ひとつの細胞（神経細胞およびその他の細胞）、ひとつの神経回路の活動を検出する、およびそれらを操作するための最先端の技術についての知識を共有し議論することにより、それら技術の現時点における問題点、将来の可能性、必要な改良等についての研究を推進することができた。
（２）また、それら細胞（神経細胞およびその他の細胞）の活性を動物個体の行動（その他の細胞の場合は活性の総和としての器官形成）と対応づけるための方法論について同様に議論し、研究を推進することができた。
これらの成果をもとに次年度以降も、脊椎動物が示す一見複雑にみえる行動を規定する基本的な神経回路はどのようなものか、それらを基にしてどのように神経ネットワークが構築され機能しているのか、を明らかにするための研究を継続して発展させていく。
Achievement:
2012 fiscal year:
We had a first conference between February 22nd-23rd at International Institute for Advanced Studies. The speakers and participants are shown below. We discussed the topics presented by the speakers.
1. Development and neuronal application of G-CaMP-type genetically encoded Ca2+ indicators with high-sensitivity and high-responsivity
Masamichi Ohkura, Junichi Nakai (Saitama Univ)
We discussed recent innovation and development of the calcium indicator GCaMP.
2. Real-time visualization of neuronal activity during perception
Akira Muto, Koichi Kawakami (National Institute of Genetics)
We discussed visualization of neuronal activity in the brain during visual perception.
3. Studying neural circuit function in zebrafish habenula
Emre Yaksi（Neuro-Electronics Research Flanders、Leuven、Belgium）
We discussed how the brain (habenula) processes olfactory information.
4. Neural circuit basis of olfactory behavior in zebrafish
Yoshihiro Yoshihara (Riken BSI)
We discussed how olfactory information is processed and causing animal behaviors..
5. The roles of the habenula in aversive learning and gain of self-confidence in aggressive behavior
Hitoshi Okamoto (Riken BSI)
We discussed the structure and function of the habenula nuclei in the vertebrate.
6. Interaction among the pigment cells forms the Turing pattern in the skin of zebrafish
Shigeru Kondo (Osaka Univ)
We discussed theoretical basis of cell-cell interactions (Turing model).
7. Quantitative detection of TALEN-mediated genome modifications in zebrafish
Atsuo Kawahara (Riken QBiC)
We discussed application of newly developed genome engineering technique TALEN to the study of organogenesis.
8. An update on reverse genetics of zebrafish
Shuo Lin（UCLA、USA）
We discussed genome engineering by homologous recombination in zebrafish.
9. Exploring roles of ADAM proteases in development using zebrafish
Atsuko Sehara (Kyoto Univ)
We discussed the roles of the ADAM protease family in the vertebrate organogenesis.
10. In vivo imaging of dendritic refinement of barrel cells in the neonatal mouse cortex
Takuji Iwasato (National Institute of Genetics)
We discussed the mechanism of synapse formation in the mouse barrel cortex.
11. Optogenetic control of glia and mind
Ko Matsui (Tohoku Univ)
We discussed optogenetic studies of the brain function using the channelrhodopsin.
12. Functional analysis of locomotor circuits in the spinal cord and brainstem
Shin-ichi Higashijima (OIIB)
We discussed the study of specific neuronal circuit that controls locomotion by electrophysiological and optogenetic approaches.
13. Dopaminergic gating of visual flow to auditory escape circuit via inhibition
Jiulin Du（Institute of Neuroscience, Chinese Academy of Sciences、Shanghai、China）
We discussed interaction of visual and auditory inputs during animal behaviors.
14. Formation and function of glycinergic synapse in zebrafish
Hiromi Hirata (National Institute of Genetics)
We discussed formation of glycinergic inhibitory synapses that control animal locomotion.

Thus, we could advance the study to get insights into recent development and future perspective of tools and methodologies to visualize and manipulate the activity of single neuronal circuits and to understand how these methodologies should be used to relate the activity of neuronal circuits to complex animal behaviors.
2013年度：

2013年度は、海外からの講演者を交えた研究会を２月２７−２８日に開催した。海外研究者招聘の経費等を考慮して年１回の会議の開催とした。
今回の会議では、イメージング手法、オプトジェネティクス手法を開発、あるいはそれらを駆使してモデル動物における脳神経回路機能研究の分野で活躍している国内外の研究者が、講演・話題提供を行なった。海外から３名の研究者を招聘し、以下のテーマで話題提供を行ない、それらについて議論・考察した。
Thomas Oertner (Center for Molecular Neurobiology Hamburg)：Synaptic Plasticity Regulates Network Wiring
Johann Bollmann (Max-Planck-Institut)：From vision to action: visually guided behavior in zebrafish
Feng Zhang (MIT)：Neuroengineering - Molecular and Optical Axes of Control
国内からは、参加研究者以外の３名の研究者を招き、以下のテーマで講演・話題提供を行ない、それらについて議論・考察した。
八尾寛（東北大学）：Optogenetic patterning of somatosensory perception
林康紀（理研BSI）：Role of cytoskeleton in hippocampal synaptic plasticity
松田信爾（慶応大学）：Molecular mechanism and controlling method for long term depression

　参加研究者からは３名が以下のテーマで講演・話題提供を行ない、それらについて議論・考察した。
中井淳一（埼玉大学）：Analysis of C. elegans neuromuscular system with genetics, imaging and optogenetics
日比正彦（名古屋大学）：Deciphering cerebellar neural circuitry using the zebrafish model
川上浩一（国立遺伝研）：Genetic dissection of functional neuronal circuits by the Gal4-UAS approach

　参加研究者の研究室から、５名の若手研究者が以下のテーマで話題提供を行ない、それらについて議論・考察した。
久野悠（理研QBiC、川原敦雄研究室）：Genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish
宮坂信彦（理研BSI、吉原良浩研究室）：Olfactory Projectome in the Zebrafish Forebrain Revealed by Genetic Single-Neuron Labeling
水野秀信（国立遺伝研、岩里琢治研究室）：NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonate
大倉正道（埼玉大学、中井淳一研究室）：GECI overview
江川遼（東北大学、八尾寛研究室）：(ChRd overview)

　これらを通じて、カルシウムセンサー等最新のイメージング技術、チャネルロドプシン等の最新の光遺伝学（オプトジェネティクス）の技術、Crisper/CAS9、Talen、Transposon等最新の遺伝子工学技術について洞察を深め、神経科学研究、脳機能研究から新しい概念を生み出すためのアプローチについて研究した。